“浑沌”----脂质纳米颗粒（LNP）制备仪

        “浑沌”脂质纳米颗粒（LNP）制备仪适配微流控芯片，通过精准控制各流道的流体流速，在微流控芯片内形成混沌流，以在极短时间形成脂相和水相的混合，快速包裹核酸，并自组装成LNP颗粒。LNP制备仪具备粒径可控，单分散度可控，包裹粒高，低样品消耗等特点，可大幅度提高客户前期配方筛选效率。

 

1、主要特点：

       （1）粒径大小可调

         粒径大小从50nm到200nm可控可调

       （2）粒径均一性好

          PDI<0.2

       （3）核酸回收率高，不浪费

         核酸包裹率>95%

         (4)操作简单

         全触屏操作，无需外接电脑；实验参数可保存。

      （5）兼容多品牌芯片

         可以使用第三方品牌芯片，适用范围更广，一机多用。

      （6）耗材兼容

         可适配国内外多种品牌注射器

      （7）智能控制

         三通道独立控制，流速比灵活设置；内置多种传感器，精准控制样品流速；

      （8）运行高效

         单次运行时间10-60s，一天内可完成上百种配方筛选。

 

二、主要参数

脂质纳米颗粒LNP制备仪设备参数

设备参数	数值
LNP粒径范围	50-200nm
包裹粒	>95%
单分散度	<0.2
总流速范围	0-40ml/min
流速控制精度	<2%
注射器选择	1-20ml注射器
样本合成量	0-50ml
控制通道	3
控制参数	体积比、流速比、总体积等

 

三、实验案例

图1：LNP的不同粒径

 

图2：LNP注射小鼠后，活体成像的图

 

四、参考实验方案

   为帮助未制备过LNP的用户能快速制备LNP，我们提供了初始制备LNP的实验方案，方案并非对每一种核酸均达到最优效果，但可以帮助用户是最短的时间获得初步的LNP，以进入到下一步的LNP效果评估实验中。

 

（1）目的：参照文献数据，以SM102、ALC0315、MC3为主要阳离子脂质制备包裹mRNA的LNP颗粒。

（2）实验原理：

   ALC-0315,MC3,SM102是三种可用于人体的脂质。在酸性条件下，质子化形成阳离子脂质，通过异种电荷静电相互吸引作用，与带负电的mRNA结合，形成LNP核心骨架。脂质与溶有mRNA的水性溶液混合后析出，自组装形成装载有mRNA的脂质纳米颗粒。本实验中采用微流控混合法，让脂质溶液与mRNA溶液在微混合器中充分、迅速、高度可重复地形成粒径均一可控的LNP。在制备过程中，脂质溶解于乙醇，核酸溶解于酸性缓冲液中，故制备得到的LNP初产物含有高浓度乙醇。因此后续还需要透析或者超滤去降残余的乙醇并将溶液体系置换至中性缓冲液中，以备后续生物学实验及长期保存。

（3）主要试剂：

   复方磷脂成分溶解于无水乙醇：包括质子化阳离子脂质（AL0315、MC31、SM102等）、辅助脂质（DSPC、DOPC等）、修饰的PEG（DMG-PEG2000、ALCohol-0159等）、胆固醇

（4）实验步骤

        1、配制复方脂质-乙醇溶液（有机相、脂相），各成分比例如下：

名称	ALC0315	MC3	SM102	DMG PEG2000	ALC0159	DSPC	胆固醇
分子量	766.3	642.1	710.2	2509.2	2464.2	790.1	386.7
配方1	46.3%				1.6%	9.4%	42.7%
配方2		50%		1.5%		10%	38.5%
配方3			50%	1.5%		10%	38.5%
1ml加入量 ug	354.8	321.05	355.09	37.64	39.43	74.27 79.02	165 148.86

          注：上述的配方比为摩尔浓度百分比

    所有成分总浓度配制12mM（约7.5mg/ml）。如果需要摸索脂质浓度对LNP最终粒径的影响条件，可以配制以下浓度：8mM（约5mg/ml），12mM（约7.5mg/ml）和16mM（10mg/ml）等进行测试。需要注意，低于4mM会难以形成均一的LNP，而过度浓度的磷脂反而会导致LNP的粒径的增大。我们推荐使用12mM浓度的复方脂质作为实验的起始条件。

 

   2、配制50mM 柠檬酸缓冲液

  使用超纯水分别配制100mM的一水合柠檬酸（分子量：210.14，称取1.05g）和二水柠檬酸钠（分子量249.1，称取1.47g）溶液各50ml，取33ml柠檬酸溶液和17ml柠檬酸钠溶液混合，用NaOH调至PH4.0。随后用超纯水定容至100ml，加入终浓度0.1%的DEPC静置30分钟。高压灭菌去除DEPC，即得50mM柠檬酸缓冲液。柠檬酸缓冲液与乙醇配制的磷脂，需要分别用0.22um的MCE滤膜（柠檬酸缓冲液）与PTFE滤膜（乙醇配制的磷脂）分别过滤，确保其终产物不含微小的固颗粒。

 

   3、计算RNA浓度，配制mRNA-柠檬酸缓冲液

  氮酸比（N/P）是mRNA-LNP包封中常用的计算核苷酸用量与磷脂用量的参数。每个碱基含有一个磷酸根，1mol的RNA或DNA即含1mol的磷酸根（P）。磷脂中仅以可电离脂质比例计算氮原子数，每摩尔复方脂质中含有0.5mol氮原子（N）。

  备注：虽然大多数的配方推荐的N/P比为6，但是实验表明，在后续的混合和超滤过程中，会损失一定的磷脂。所以在实践中，推荐你（可根据实验需要）将N/P比提高到8。更高的N/P可以降低超滤和透析引起的粒径变大，并提高mRNA的利用率。缺点是可能会增大对细胞的毒性，降低细胞的存活率。对于包封率，高N/P比也并无优势。

 

  核糖核苷酸（RNA)的平均分子量为339.5，形成RNA脱水聚合后NEB推荐计算均值为320.5g/mol。脱氧核糖核苷酸的平均分子量为327.0，形成双链DNA脱水聚合后，NEB推荐计算均值为308.0g/mol。以可电离脂质比例计算氮原子数，每摩尔复方脂质中含有0.5mol氮原子。

 

     每mmol脂质可包裹RNA的计算公式为：=[0.5/(N/P比）]X320.5;

                                                                              DNA为：=[0.5/(N/P比）]X308.0;

 

     以N/P为6计算，每毫摩尔总脂质可包载的RNA质量：(0.6/6)X320.5=26.75mg；

     以N/P为6计算，每毫摩尔总脂质可包载的DNA质量：(0.6/6)X330=25.67mg；

 

     以柠檬酸缓冲液/复方磷脂流速比（FRR）=3，N/P=6，磷脂浓度=12mM为例，进行核酸使用量的计算：

     柠檬酸缓冲液中RNA浓度：（26.71X12）/3=106.84ng/ul

     柠檬酸缓冲液中DNA浓度：（25.67X12）/3=102.68ng/ul

                                                                      复方磷脂浓度与缓冲液中核酸浓度对应表

脂质浓度mM	8	12	16	8	12	16
N/P	6	6	6	8	8	8
FRR	3	3	3	3	3	3
ssRNA浓度ng/ul	71.23	106.84	142.45	53.41	80.12	106.83
dsDNA浓度 ng/ul	68.45	102.68	136.91	51.33	77	102.67

 

           4、微流控混合

               使用智矩未来LNP制备仪，设定总流速和FRR。

 

           5、粒径和PDI的检测

    值得注意的是，由于LNP初产物中含25%乙醇，高浓度乙醇会导致直接检测初产物粒径有80%以上的偏差。因此需要及时地使用柠檬酸缓冲液将初产物稀释5倍进行检测。将乙醇的浓度稀释至5%以下，所测量的粒径才相对较为准确（误差<10%)。

  备注：LNP初产物中高浓度乙醇会造成LNP融合，故推荐合成后立即用缓冲液稀释。若进行透析则无需稀释，尽快（10min内）将产物置于透析袋和透析液中进行透析。透析液推荐使用1XPBS pH7.4或20mM Tris-HCl pH7.4，更换缓冲液含用含8%蔗糖 的PSB溶液或Tris溶液。

 

   6、包封率的测定

   可以使用Qubit来进行测定。

   计算方法是：包封率%=1-（破乳后核酸量-破乳前核酸量）/破乳后核酸量X100%

           核酸利用率%=（破乳后核酸量-破乳前核酸量）/核酸投入量X100%

   测定破乳前核酸量：使用柠檬酸缓冲液进行标准品稀释。

   破乳：使用TE配制4% Triton X-100，与LNP终产物1：1混合，静置5分钟后再测定。

   注：测定破乳后的核酸时，其标准曲线的稀释液中也应加入终浓度2% Triton X-100。